新型去異味香水的開發(fā)與設(shè)計

利用嗅覺感受器技術(shù)的氣味能有效控制身體異味。

各種令人不快的氣味，如身體異味，正在成為一個社會問題，部分原因是全球變暖和生活方式的多樣化。根據(jù)Statista匯編的數(shù)據(jù)，到2021年，除臭劑市場的全球收入預(yù)計將達到49.302億美元，到2025年的復(fù)合年增長率將達到5.2%。預(yù)計2021年最大的五個市場將是美國(49.3億美元)、巴西(24.86億美元)、德國(10.17億美元)、英國(8.92億美元)和法國(7.31億美元)；

(www.Statista.com/outlook/70070100/109/deodorants/united-states#market-arpu)。

相應(yīng)地，市場對各種高效除臭劑產(chǎn)品的需求也在迅速增加。對于它們的開發(fā)，通常使用化學(xué)除臭劑和/或具有遮蔽效果的香水來減少惡臭的技術(shù)。在惡臭掩蔽技術(shù)領(lǐng)域，嗅覺受體(OR)檢測技術(shù)作為高通量篩選高效掩蔽劑的最新技術(shù)，受到了極大的關(guān)注。

在這項研究中，我們在這項技術(shù)的基礎(chǔ)上，專注于抑制衰老和腋臭這兩種身體惡臭。OR2C1對衰老和腋下關(guān)鍵氣味成分(E)-2-壬烯醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮均有反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)了OR2C1的潛在拮抗劑。

拮抗香味物質(zhì)在感官評定中明顯抑制了惡臭物質(zhì)的氣味強度。此外，在使用含有拮抗劑的香水的實驗中，這種效果得到了明顯的驗證。

綜上所述，利用嗅覺感受器技術(shù)成功地開發(fā)出了控制身體異味的香水。這種方法被認(rèn)為是開發(fā)高性能遮蔽香料組合物的有效和快速的方法。

人體異味的分析與鑒定

為了改善生活環(huán)境，人們迫切需要對日常生活中的難聞氣味進行更有效的除臭。其中，人們對體味的意識最近有所提高。

體味大致分為“身體各個部位的氣味”，如口臭、腳臭、腋臭和頭皮氣味，以及“從軀干發(fā)出的混合氣味”。眾所周知，后者會隨著年齡的增長而變化，而且中老年人很容易不喜歡與年齡有關(guān)的氣味。這種氣味被稱為老化氣味(Kareishu)。據(jù)報道，2-壬烯醛和2-辛烯醛等不飽和醛是這種氣味的關(guān)鍵物質(zhì)。[1] 此外，青春期后腋窩產(chǎn)生的特殊氣味是最強烈的身體異味之一，使許多人感到惱火。據(jù)報道，1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮等乙烯基酮類化合物具有極低的氣味閾值和強烈的金屬氣味，是腋臭的關(guān)鍵成分。它們對腋臭有很大的影響。[2] 圖1顯示了每種臭味的關(guān)鍵成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1 每種惡臭主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

現(xiàn)代去臭方案

針對各種惡臭，已經(jīng)開發(fā)了許多除臭方法。除臭方法一般分為生物法、化學(xué)法、物理法和感覺法。感官方法包括“遮蓋”，這是各種產(chǎn)品中最常用的，氣味被比惡臭更強烈的香味成分所掩蓋。然而，過度的“遮蓋”往往會因為氣味過濃而讓消費者感到不舒服。

我們聞到的氣味是分子量約為30-300的揮發(fā)性有機化合物(氣味分子)的聚合體。嗅覺感受器起到傳感器的作用，檢測每個氣味分子。

據(jù)報道，在人類中有396種嗅覺受體，在老鼠中有1130種。[3] 關(guān)于氣味分子被嗅覺感受器接受和識別氣味的機制已經(jīng)進行了大量的研究。最新技術(shù)使高效掩蔽劑的高通量篩選成為可能。近年來，市場上出現(xiàn)了一些基于調(diào)節(jié)嗅覺感受器活性技術(shù)的除臭劑產(chǎn)品。

在目前的工作中，我們致力于利用嗅覺感受器技術(shù)開發(fā)氣味控制香料。老化氣味和腋臭是體臭的全球重要代表，被選為目標(biāo)氣味。使用OR分析技術(shù)，我們搜索對惡臭的主要成分有反應(yīng)的OR，并搜索抑制OR活性的香料。我們應(yīng)用這些材料，成功地研制出了新型高效除臭香料。

克隆人嗅覺受體細(xì)胞的材料與方法

通過PCR從人類基因組DNA中克隆出398個人OR基因：女性(Promega Corporation，Madison)。將牛視紫紅質(zhì)N端20個氨基酸殘基插入pME18S載體，并將獲得的OR基因插入其下游，得到人OR基因表達載體。

熒光素酶報告基因檢測

HEK293T細(xì)胞在37°C、5%CO2氣氛中培養(yǎng)。對已報道的熒光素酶報告基因檢測方法進行了改進。[4] 采用雙葡萄熒光素酶檢測系統(tǒng)(Promega)測定螢火蟲和海腎蟲的熒光素酶活性。用含有cAMP反應(yīng)元件啟動子的螢火蟲熒光素酶載體pGL4.29[luc2P/Cre/hygro](Promega)檢測受體活性。用含有胸苷激酶啟動子的海腎蟲熒光素酶載體pGL4.74[hRluc/TK](Promega)作為細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)對照。

將受體運輸?shù)鞍?短(RTP1S)基因?qū)雙ME18S載體，增強ORS的功能表達。將50 ng的人嗅覺受體(OR)基因表達載體、10 ng的RTP1S載體、10 ng的pGL4.29和5 ng的pGL4.74用脂質(zhì)體3000(Life Technologies，Carlsad，California)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在96個多聚D-賴氨酸涂層的孔板(BioCoat，Corning Inc.，New York)中培養(yǎng)24小時。

去除培養(yǎng)液后，用含氣味的50μL CD293培養(yǎng)基(Life Technologies)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并添加20μM的L-谷氨酰胺。

刺激3h后，用微板式發(fā)光儀Centro LB960(Berthold Technologies GmbH，維也納)測量其發(fā)光強度。在對惡臭成分有反應(yīng)的ORs的篩選和OR2C1反應(yīng)抑制劑的篩選中，細(xì)胞培養(yǎng)在348個涂有聚D-賴氨酸的孔板中(Viewplate，PerkinElmer，Waltham，Massachusetts)，實驗規(guī)?？s小到上述數(shù)量的三分之一。用TriStar2LB942(Berthold)微板式發(fā)光儀測量其發(fā)光強度。

計算每孔螢火蟲發(fā)光與雷尼拉發(fā)光的比值。嗅覺受體反應(yīng)強度用倍增(FI)值表示，F(xiàn)I值是用氣味刺激細(xì)胞的比值除以無氣味刺激的比值計算出來的。

在抑制惡臭成分對OR2C1反應(yīng)的實驗中，它們的抑制效率用惡臭成分和拮抗劑混合物的FI值除以沒有拮抗劑的FI值計算出的歸一化響應(yīng)值來表示。用GraphPad Prism 6進行數(shù)據(jù)分析。

感官評價方法

20個訓(xùn)練組按照六點法氣味強度測量法進行感官評價。氣味強度根據(jù)強度分為以下幾類：0，無氣味；1，很弱；2，弱；3，明顯；4，強；5，很強。當(dāng)只出現(xiàn)惡臭時，得分設(shè)為4。將兩個棉球放入塑料瓶中，其中一個有10μL的惡臭，另一個有1μL的受試物質(zhì)。測試員每聞一下瓶子，就對惡臭的強度進行評分(圖2)。

圖2 感官評價示意圖。(a)嗅聞所用的塑料瓶；(b)如何嗅聞氣味。

異味成分

老化臭味：(E)-2-壬烯醛(東京化學(xué)工業(yè)株式會社)溶于0.1wt%檸檬酸三乙酯(東京化學(xué)工業(yè)株式會社)

腋臭：1-辛烯-3-酮(東京化學(xué)工業(yè))溶于0.1wt%檸檬酸三乙酯(東京化學(xué)工業(yè)株式會社)

異味模型

根據(jù)表2制備了含有(E)-2-壬烯醛和(E)-2-辛烯醛的老化惡臭模型(東京化學(xué)工業(yè))和含有1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮的腋臭模型(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas)。表1中列出的酸是由東京化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)的。通過添加關(guān)鍵成分，兩種模型的臭味都達到了與實際老化臭味和腋臭高度相關(guān)的程度。

表1 (a) 老化味模型

(b) 腋臭味模型

香味模型

一種花香香水是由高砂鑒臣國際公司制作的模型香水(日本東京)。這款香水的組成原料是為了不抑制OR2C1的反應(yīng)而選擇的。在此模型香料中分別添加0.1-1.0%的拮抗劑。

人體ORs老化及腋臭關(guān)鍵成分篩查結(jié)果分析

我們篩選出對(E)-2-壬烯醛有反應(yīng)的人ORs。將瞬時表達人ORS的HEK293T細(xì)胞暴露于60μM的(E)-2-壬烯醛，用熒光素酶報告基因檢測其反應(yīng)。OR2C1對(E)-2-壬烯醛反應(yīng)強烈，OR1D2、2J2、4E2、5P3和52N2反應(yīng)弱(圖3)。

圖3 (E)-2-壬烯醛的人ORs的篩選(注：用熒光素酶報告基因檢測瞬時表達人ORs的HEK293T細(xì)胞對60μM(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)。紅色條表示對倍增值為2或更大的(E)-2-壬烯醇刺激有反應(yīng)的OR。X軸上帶彩色條的數(shù)字(1-14、51、52和56)表示OR族，T表示TAARs)

我們證實了OR2C1對(E)-2-壬烯醛的量效關(guān)系。用不同濃度的(E)-2-壬烯醛刺激表達OR2C1的細(xì)胞或模擬細(xì)胞，用熒光素酶比色法測定它們的反應(yīng)。大于10μM的(E)-2-壬烯醛(圖4A)呈劑量依賴性地激活OR2C1，而模擬細(xì)胞對任何濃度的(E)-2-壬烯醛(圖4A)均無反應(yīng)。此外，我們還嘗試將表達OR2C1的細(xì)胞應(yīng)用于其他惡臭成分。結(jié)果，細(xì)胞不僅對(E)-2-辛烯醛(稱為老化惡臭關(guān)鍵成分)，而且對1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮(稱為腋臭關(guān)鍵成分)也表現(xiàn)出劑量依賴性的反應(yīng)(圖4B-D)?？偠灾?，OR2C1對所有四種惡臭成分都有反應(yīng)。

圖4 OR2C1和模擬細(xì)胞對老化味和腋臭關(guān)鍵成分的反應(yīng)（注：瞬時表達OR2C1的HEK293T細(xì)胞對每個濃度的惡臭成分的反應(yīng)是用熒光素酶報告基因檢測的。惡臭成分為(A)(E)-2-壬烯醛；(B)(E)-2-辛烯醛；(C)1-辛烯-3-酮；(D)1，5-辛二烯-3-酮。橙色條表示OR2C1的倍增值，灰色條表示模擬的平均值。每條代表平均值±SE(n=3)）

尋找OR2C1的潛在拮抗劑

為了開發(fā)具有遮蔽作用的香料，我們篩選了800種使用(E)-2-壬烯醛的香料。我們用60μM(E)-2-壬烯醛和香料的混合物刺激表達OR2C1的細(xì)胞，并用熒光素酶測定法測定它們的反應(yīng)。結(jié)果，數(shù)十種材料抑制了細(xì)胞對(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。

在這些潛在的拮抗劑中，我們選擇了6種物質(zhì)：1，4-二氧雜環(huán)庚烷-5，17-二酮(麝香T（高砂鑒臣國際公司的商標(biāo)名），化合物1)，2-甲基-4-[(1R)-2,2,3-三甲基環(huán)丙-3-烯1-基]丁-2-烯-1-醇(辛地諾（高砂鑒臣國際公司的商標(biāo)名），化合物2)、2,2,6-三甲基-α-丙基環(huán)己烷丙醇(Dextramber(高砂鑒臣國際公司的商標(biāo)名)，化合物3)、桉樹精油(EO)、廣藿香精油(EO)和香根草精油(EO)(表2)?；衔?-3由高砂鑒臣國際香料公司制造，精油由大阪早矢仕精細(xì)化工有限公司制造。它們的抑制活性被詳細(xì)確認(rèn)如下。

表2 拮抗候選化合物的特征

首先，我們評價了化合物1的劑量-抑制關(guān)系。我們測定了不同濃度化合物1對60μM(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)?；衔?在30μM和100μM(圖5 A)時顯著降低了OR2C1對(E)-2-壬烯醛的反應(yīng)。我們證實了使用(E)-2-壬烯醛發(fā)現(xiàn)的OR2C1拮抗劑是否也能抑制同樣的受體對其他惡臭成分的反應(yīng)。除了將配體改變?yōu)?E)-2-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮外，我們以與上述相同的方式進行了考察?；衔?對上述三種惡臭成分的OR2C1反應(yīng)均有抑制作用，且呈劑量依賴性(圖5 B-D)。

我們進一步從拮抗劑中選擇了化合物2和3、桉樹EO、廣藿香EO和香根草EO，并評價了它們對OR2C1反應(yīng)的抑制作用和對腋臭成分的抑制作用。我們用60μM(E)-2-壬烯醛或30μM-1-octen-3-one的混合物和5種不同濃度的物質(zhì)分別刺激OR2C1表達的細(xì)胞，并用熒光素酶測定法測定它們的反應(yīng)。所有五種材料都顯著抑制了OR2C1對衰老(圖6 A-E)和腋窩成分(圖7 A-E)的反應(yīng)。

圖5 化合物1抑制OR2C1對老化味和腋臭關(guān)鍵成分的嗅覺反應(yīng)（注：用熒光素酶報告基因分析法檢測瞬時表達OR2C1的HEK293T細(xì)胞對各濃度化合物1惡臭關(guān)鍵成分的反應(yīng)。惡臭成分為：(A)60μM(E)-2-壬烯醛；(B)60μM(E)-2-辛烯醛；(C)30μM-1-辛烯-3-酮；(D)60μM-1，5-辛二烯-3-酮。條形表示OR2C1的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)值，表示為平均值±SE(n=3)。采用單因素方差分析和Dunnett‘s檢驗，確定控制值(僅有惡臭成分)和測試值之間差異的顯著性。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不顯著。）

圖6 拮抗劑對OR2C1對(E)-2-壬烯醛反應(yīng)的抑制作用（注：用熒光素酶報告基因分析法檢測瞬時表達OR2C1的HEK293T細(xì)胞對60μM(E)-2-壬烯醛對各濃度拮抗劑的反應(yīng)。拮抗劑為(A)化合物2，(B)化合物3，(C)桉樹EO，(D)廣藿香EO，(E)香根草EO。條形表示OR2C1的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)值，表示為平均值±SE(n=3)。采用單因素方差分析和Dunnett‘s檢驗，確定對照((E)-2-壬烯醛)與試驗值之間差異的意義。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不顯著）

圖7 拮抗劑對OR2C1對1-辛烯-3-酮反應(yīng)的抑制作用（注：用熒光素酶報告基因分析法檢測瞬時表達OR2C1的HEK293T細(xì)胞對30μM1-octen-3-one與各濃度拮抗劑的反應(yīng)。拮抗劑為(A)化合物2，(B)化合物3，(C)桉樹EO，(D)廣藿香EO，(E)香根草EO。條形表示OR2C1的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)值，表示為平均值±SE(n=3)。采用單因素方差分析和Dunnett‘s檢驗，確定對照(單獨使用1-octen-3-one)和測試值之間差異的顯著性。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不顯著）

感官評價

進行感官評估，以驗證該拮抗劑是否在人類嗅覺中起到體味抑制劑的作用。首先，檢測了一種香料對每種惡臭的感官抑制效果。化合物1、2、3和桉樹EO對(E)-2-壬烯醛和1-辛烯-3-酮的氣味強度有抑制作用。另一方面，水楊酸芐酯沒有抑制OR2C1反應(yīng)，也沒有降低每種氣味的強度(圖8 A，B)。

接下來，進行了更多的實際測試，以驗證將其應(yīng)用于生產(chǎn)級應(yīng)用的有效性。我們分別制備了含有拮抗劑的香水、老化惡臭模型和腋臭模型，它們主要由它們的關(guān)鍵成分組成。感官評價結(jié)果表明，該香精對模型惡臭(圖8 C、D)具有良好的防臭效果。不加拮抗劑的模型香水略微降低了惡臭的強度，并以此作為對照。這些結(jié)果從實際應(yīng)用的角度清楚地說明了這一點。

圖8 拮抗劑對各種惡臭抑制作用的感官評價（注：感官評定由20個訓(xùn)練有素的評審團按照六分制氣味強度測量法進行：0(無氣味)至5(非常強烈)。氣味與受試物的組合為：(A)(E)-2-壬醛香料；(B)1-辛烯-3-酮香料；(C)有/無拮抗劑的陳化氣味模型香料；(D)有/無拮抗劑的腋臭模型香料；(B)1-辛烯-3-1-酮香料；(C)有/無拮抗劑的老化氣味模型香料；(D)有/無拮抗劑的腋臭模型香料。每條代表平均值±SE(n=20)）

討論

為了開發(fā)有效去除難聞氣味的新香料，我們使用OR分析技術(shù)來尋找對惡臭關(guān)鍵成分有反應(yīng)的ORs和降低OR活性的香料。

選擇(E)-2-壬烯醛和(E)-2-辛烯醛作為陳化惡臭成分，1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮作為腋臭成分。

我們發(fā)現(xiàn)一些ORs對(E)-2-壬烯醛F-4有反應(yīng)，其中OR2C1對所有四種惡臭成分都有劑量依賴性的反應(yīng)(圖4 A-D)?？紤]到OR2C1對辛硫醇和壬硫醇也有反應(yīng)，OR2C1可能識別鏈長約為8-9的線性分子[5]，這些OR2C1配體彼此之間沒有相似的氣味。在人類嗅覺系統(tǒng)中，與高度依賴OR5AN1的麝香氣味知覺不同，OR2C1可能并不單獨對氣味質(zhì)量起到識別作用[6,7]。

我們篩選了抑制OR2C1對(E)-2-壬烯醛反應(yīng)的芳香物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個候選拮抗劑。其中，化合物1抑制OR2C1對所有四種惡臭成分(圖5 A-D)的活性。此外，化合物2、3和三種精油中的每一種都降低了OR2C1對(E)-2-壬烯醛和1-辛烯-3-酮(圖6 A-E和圖7 A-E)的反應(yīng)。這表明一個拮抗劑可以掩蓋多種類型的惡臭。

在感官評價中，拮抗劑還降低了老化氣味和腋臭成分的氣味強度(圖8 A，B)。感官評價結(jié)果表明，拮抗劑確實抑制了惡臭，支持了該方法的有效性。此外，含有這些拮抗劑的香精對模型衰老和腋臭(圖8 C，D)有很好的控味效果。

有趣的是，一種拮抗劑可以抑制老化氣味和腋臭的惡臭。另一方面，OR2C1抑制活性的有效性與感覺評價中的掩蔽性能之間沒有明顯的相關(guān)性。造成這種差異的原因之一是感官評價中的揮發(fā)性等物理特性的影響。此外，與OR2C1以外的OR的交互也不能被忽略。雖然OR分析不是一種完美無缺的方法，但它對于掩蔽劑候選的選擇仍然是非常有效的，而且這種方法可以顯著減少開發(fā)工作量。

結(jié)論

OR2C1被發(fā)現(xiàn)是老化味和腋臭關(guān)鍵氣味成分共同的受體。

利用香料發(fā)現(xiàn)了OR2C1的潛在拮抗劑。感官評價結(jié)果表明，拮抗香料對惡臭物質(zhì)的惡臭強度有明顯的抑制作用。此外，在使用含有拮抗劑的香水的實驗中，這種效果也得到了明顯的驗證。這些結(jié)果表明，從實際應(yīng)用的角度來看，該方法具有重要的意義。綜上所述，利用嗅覺感受器技術(shù)，成功開發(fā)了控制人體異味的香水。這種方法被認(rèn)為是開發(fā)高性能遮蔽香料組合物的有效和快速的方法。

最后，我們可能要注意到，單靠拮抗劑來控制惡臭并不容易。這是因為惡臭通常不只由一個關(guān)鍵成分組成。最好的解決方案是將該方法與其他控制惡臭技術(shù)結(jié)合使用，這些技術(shù)通過與整個惡臭相協(xié)調(diào)來有效地減少不適感。

將此方法應(yīng)用于我們最終的香精創(chuàng)作中，有望在除臭方面帶來新的突破。

宮原久志在日本神奈川高砂鑒臣國際香料的企業(yè)研發(fā)部門任職，電子郵件：[email protected]

參考文獻

1. S. Haze, Y. Gozu, S. Nakamura, Y. Kohno, K. Sawano, H. Ohta, and K. Yamazaki, J. Invest. Dermatol., 116(4) 520-524 (2001)

2. S. Iida, N. Ichinose, T. Gomi, K. Someya, K. Hirano, M. Ogura, S. Yamazaki, and K. Sakurai, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 37(3) 195-201 (2003)

3. Y. Niimura, A. Matsui, and K. Touhara, Genome Res., 24, 1485-1496 (2014)

4. H. Zhuang and H. Matsunami, Nat. Protoc. 3, 1402–1413 (2008)

5. H. Saito, Q. Chi, H. Zhuang. H. Matsunami, and J. D. Mainland, Sci. Signal., 2(60), ra9 (2009)

6. M. Shirasu, K. Yoshikawa, Y. Takai, A. Nakashima, H. Takeuchi, H. Sakano, and K. Touhara, Neuron, 81, 165-178 (2014)

7. N. Sato-Akuhara, N. Horio, A. Kato-Namba, K. Yoshikawa, Y. Niimura, S. Ihara, M. Shirasu, and K. Touhara, J. Neurosci., 36(16), 4482-4491 (2016)