生物合成香料的化學(xué)組成、可持續(xù)性和天然性

Mathilde Lecourt and Sylvain Antoniotti*

Université C?te d’Azur, CNRS

Institut de Chimie de Nice

Parc Valrose, 06108 Nice cedex 2, France.

E-mail: [email protected]

摘要：白色生物技術(shù)已出現(xiàn)在生物化學(xué)制造過(guò)程中，以提供滿足社會(huì)對(duì)天然、環(huán)保負(fù)責(zé)和可持續(xù)材料新興趣的香料成分。因此，在這些主題上開展了激烈的研發(fā)活動(dòng)，導(dǎo)致科技論文和專利申請(qǐng)報(bào)告了生物催化、代謝工程、合成生物學(xué)、生物合成闡明、基因編輯和克隆以及分析化學(xué)中最先進(jìn)方法的組合。在這篇小型綜述中，我們從過(guò)去6年的科學(xué)文章和專利調(diào)查中挑選了一系列新穎的生物技術(shù)工藝和成分，并從化學(xué)、可持續(xù)性和自然性方面進(jìn)行了分析。一方面，對(duì)代謝工程進(jìn)行分類，并允許精油替代物或單分子成分的生物技術(shù)合成，另一方面，通過(guò)對(duì)天然復(fù)雜物質(zhì)的化學(xué)成分進(jìn)行特定和選擇性的酶改性，對(duì)其化學(xué)組成進(jìn)行修改。

自2000年以來(lái)，出現(xiàn)了許多涉及生物催化的方法，以從數(shù)量或質(zhì)量上改善香料中使用的精油和天然提取物。在這方面，主要使用纖維素酶、果膠酶和糖苷酶對(duì)植物材料進(jìn)行預(yù)處理以提高提取或蒸餾產(chǎn)量，以促進(jìn)揮發(fā)性分子從細(xì)胞隔層中釋放。隨著范式的重大轉(zhuǎn)變，一些作者開始研究在后處理過(guò)程中直接對(duì)天然復(fù)合物混合物（如精油和天然提取物）使用生物催化，而化學(xué)家通常傾向于對(duì)純物質(zhì)使用生物催化。[1]然而，該領(lǐng)域的范圍和復(fù)雜性最近有所增加。不僅在前處理和后處理方法中使用了新的酶，而且在工業(yè)中發(fā)現(xiàn)并實(shí)施了新的生物技術(shù)和工藝。這就是新類型成分的誕生，例如通過(guò)代謝工程獲得的生物技術(shù)成分，無(wú)論是作為生物生產(chǎn)的精油還是純化合物。它們是在生物反應(yīng)器中由來(lái)自金合歡基二磷酸或葡萄糖等簡(jiǎn)單碳源的重組微生物產(chǎn)生的。[2] 因此，有高度的生物資源（一般高達(dá)100%），并與其傳統(tǒng)的自然對(duì)應(yīng)物密切相關(guān)。隨著過(guò)去二十年來(lái)分子生物學(xué)的進(jìn)步和許多物種基因組的測(cè)序，現(xiàn)在可以從野生天然來(lái)源（細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物等）中選擇編碼所需酶的基因，并將其轉(zhuǎn)移到重組生物體中，通常為大腸桿菌或曲霉屬。。如果多個(gè)編碼不同酶的基因被轉(zhuǎn)移，宿主的代謝可以被修改，從而產(chǎn)生相對(duì)大量的有價(jià)值的產(chǎn)品，其化學(xué)復(fù)雜性取決于組裝的生物合成步驟的數(shù)量。代謝途徑，有時(shí)來(lái)自不同物種，可以混合或重建，使生物合成完全或部分可以從簡(jiǎn)單的前體進(jìn)行。最后，基因可以可以隨機(jī)或選擇性地進(jìn)行修改，以提高生物工藝的性能：產(chǎn)量、體積生產(chǎn)率、對(duì)映體選擇性、底物范圍、溫度耐受性等…

代謝工程與一類新的配料

在本節(jié)中，我們將查閱有關(guān)使用重組生物體的科學(xué)文獻(xiàn)和許多專利，這些利用重組生物表達(dá)基因編碼植物中涉及生物合成氣味分子的酶，主要是萜烯類和萜類化合物，但不僅僅是萜類。這些經(jīng)過(guò)改性的有機(jī)體可以用來(lái)生產(chǎn)精油等效物或單分子。

新型天然復(fù)合混合物

廣藿香Pogostemon cablin

廣藿香油主要成分的生物合成途徑已被深入研究，可能最重要的發(fā)現(xiàn)是，盡管廣藿香精油中存在化學(xué)多樣性（大部分為倍半萜烴），[3]實(shí)際上有少量萜烯合成酶在起作用，并占這種多樣性的重要部分。[4] 特別是，發(fā)現(xiàn)了編碼多功能倍半萜合酶的單一廣藿香醇合酶cDNA，可從大腸桿菌中異源表達(dá)，通過(guò)his標(biāo)記技術(shù)純化，并用于以金合歡基、香葉基和橙花基二磷酸為底物的生物催化反應(yīng)。如果(E,E)-金合歡基二磷酸（FPP）被環(huán)化為(E,E)-吉馬二烯基陽(yáng)離子和愈創(chuàng)木酰陽(yáng)離子，則形成了廣藿香精油中的幾種重要倍半萜，如（-）-廣藿香醇、塞舌爾烯、α-、β-和γ-廣藿香烯、α-愈創(chuàng)木烯和α-布藜烯（dguaiene）（方案1）。

方案1.一次起始環(huán)化反應(yīng)所得倍半萜烴的化學(xué)多樣性。氫化物位移可以是1,2-或1,3-位移。W-M代表Wagner-Meerwein。

因此，使用單一的天然起始材料，如(E,E)-金合歡基二磷酸，可以生產(chǎn)廣藿香精油倍半萜烯和倍半萜的混合物，從而進(jìn)入一類與蒸餾成分具有化學(xué)和感官相似性的新型生物技術(shù)成分。

瑞士F&F公司Firmenich&Cie提交了多項(xiàng)專利，成分Clearwood?于2014年推出，是一種相當(dāng)于廣藿香精油的“純凈”產(chǎn)品，[6]通過(guò)可持續(xù)工藝獲得，具有供應(yīng)穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)。[7] 其天然等級(jí)受到質(zhì)疑，[8]這不僅是因?yàn)樵讷@得珍貴倍半萜烯混合物的過(guò)程中使用了轉(zhuǎn)基因生物，還因?yàn)榇嬖趶V藿香醇乙醚，該物質(zhì)未列入廣藿香精油130種已公布的成分中，之前在自然界中也未被鑒定。[9]

同樣，表達(dá)廣藿香醇合成酶變體的重組大腸桿菌菌株已成功用于從(E,E)-金合歡基二磷酸生產(chǎn)廣藿香醇和一些相關(guān)倍半萜。[10] 觀察到廣藿香精油化合物，但有趣的是，還使用(2Z,6E)-和(2E,6Z)-金合歡基二磷酸測(cè)試了酶反應(yīng)的立體特異性。前者主要提供α-和γ-古蕓烯和大香葉烯B，后者提供未知的倍半萜烯（C15H24）和蠕蟲大香葉烷。兩者都不能轉(zhuǎn)化為廣藿香醇，即C2-C3和C6-C7位的碳碳雙鍵不同立體化學(xué)導(dǎo)致了E,E異構(gòu)體以外的其他碳離子中間體。對(duì)于香葉基和橙花基二磷酸，形成檸檬烯、α和去磷酸化萜烯醇的混合物。

Akigalawood?是最近與廣藿香油合作推出的另一種新型生物技術(shù)成分。這一種目前是奇華頓的專屬配料。[11] 專利中明確提到它是一種含有莎草奧酮的材料。[12]莎草奧酮是一種有氣味的倍半萜類物質(zhì)，存在于多種天然產(chǎn)品中，尤其是紅葡萄酒中，具有辛辣、木香的嗅覺感受。[13] 已闡明了葡萄中α-愈創(chuàng)木烯的生物合成，并鑒定了相關(guān)基因。[14]

奇華頓最近的一項(xiàng)專利申請(qǐng)中提到，利用表達(dá)葡萄和廣藿香倍半萜合成酶的重組微生物從金合歡基二磷酸生產(chǎn)α-愈創(chuàng)木烯和莎草奧酮，以及沉香屬（agarwood）的氧化酶。[15] 該專利提到微生物可以在體內(nèi)從糖中生產(chǎn)金合歡基二磷酸，但該特定點(diǎn)未在所有權(quán)中列出。在另一系列專利中，提出了一種酶法從α-愈創(chuàng)木烯和α-布藜烯中提取莎草奧醇的方法。[16] 它基于漆酶的使用，在存在或不存在化學(xué)介質(zhì)（例如1-羥基苯并三唑）的情況下，并特別指出起始的倍半萜烯可以被廣藿香精油的輕餾分所取代，這些輕餾分通常含有不同比例的α、β和δ-愈創(chuàng)木烯、塞舌爾烯和β、δ-廣藿香烯?？紤]到漆酶的已知反應(yīng)性，通過(guò)α-愈創(chuàng)木烯的直接烯丙基氧化形成莎草奧醇后，很可能在其他氧化產(chǎn)物中也會(huì)獲得莎草奧酮（方案2）。[17]

銀杏生物工程公司最近提交的一項(xiàng)專利申請(qǐng)描述了通過(guò)使用由稀有或滅絕植物（如野木槿屬、大花白楊屬、長(zhǎng)毛錦雞兒屬、托葉錦雞兒屬、虎杖屬，和溫特迪亞狹葉屬）核酸序列組裝而成的嵌合萜烯合成酶，形成倍半萜烯和倍半萜類化合物，包括愈創(chuàng)木烯及其衍生物。[18]

方案二. 將α-愈創(chuàng)木烯和α-布藜烯轉(zhuǎn)化為莎草奧醇和莎草奧酮。

檀香木（檀香屬）

檀香油是另一種重要的木本天然成分，它是通過(guò)水蒸氣蒸餾檀香木心而獲得的。東印度的品質(zhì)來(lái)源于檀香。檀香通常產(chǎn)于印度尼西亞和斯里蘭卡，最近在西澳大利亞北部的種植園中也有種植。[19] 檀香油主要由倍半萜烯醇組成，其中(Z)-α-檀香醇和（Z）-β-檀香醇占80-90%。公認(rèn)這些檀香醇也是檀香香氣的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，歸因于(+)-(Z)-α-檀香醇和(-)-(Z)-β-檀香醇對(duì)映體。最近的生物合成研究揭示了一種常見的倍半萜合酶在檀香屬植物中的作用，它可以將金合歡基二磷酸轉(zhuǎn)化為α-和β-檀香烯、反式β-香檸檬烯、表-β-檀香烯和(Z)-β-金合歡烯。[20] 通過(guò)P450單加氧酶對(duì)α-和β-檀香烯的前-(Z)甲基進(jìn)行化學(xué)選擇性羥基化，形成檀香的芳香倍半萜醇。[21]通過(guò)在重組細(xì)胞中克隆這些基因，可以工業(yè)化實(shí)施發(fā)酵過(guò)程，以提供2020年5月推出的Dreamwood?配料（方案3）。[22]

方案3. 由檀香屬植物倍半萜合酶（SS）將金合歡基二磷酸生物轉(zhuǎn)化為α-和β-檀香烯混合物，然后通過(guò)P450單加氧酶進(jìn)行化學(xué)選擇性羥基化。

重組生物產(chǎn)生的純分子

降龍涎醚Ambrox

降龍涎醚是一種倍半萜類化合物，有許多商標(biāo)名（Ambroxide?、Ambroxan?、Ambrofix?、Ambermox?、Ambermor?、Ambrox?super）。這是動(dòng)物原料龍涎香的氣味原理，龍涎香是抹香鯨（Physetter macrocephalus）的一種病理性分泌物。

開發(fā)了可行的合成路線，來(lái)避免道德、經(jīng)濟(jì)和供應(yīng)問(wèn)題。二萜二醇-雪松酚的半合成已建立，該化合物是制造鼠尾草精油（Salvia sclarea）的副產(chǎn)品。然而，由于鼠尾草精油的穩(wěn)定和適度消費(fèi)以及降龍涎醚的大量和日益增加的使用，這種耦合制造工藝不能滿足對(duì)雪松醇的需求。通過(guò)生物合成克隆鼠尾草中的雙（香葉基）二磷鹽所涉及的兩種酶后，產(chǎn)生共表達(dá)成團(tuán)泛球菌和雙（香葉基）二磷鹽以及兩種二萜合成酶的工程可獲得大腸桿菌菌株（方案4）。[23]因此，從30 g/L甘油作為碳源開始，形成高達(dá)1.5 g/L的雪松醇，以及15%的13-表-香紫蘇醇。隨后進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化研究，包括代謝工程。[24]

方案4. 雙（香葉基）二磷鹽制備的香葉醇和降龍涎醚。

同樣，也可以從表達(dá)煙草（Nicotiana glutinosa）的賴百當(dāng)醇合成酶和香紫蘇醇合成酶的重組微生物中生產(chǎn)香紫蘇醇，并通過(guò)各種已知反應(yīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為降龍涎醚。[25]

通過(guò)(E)-β-金合歡烯得到龍涎呋喃Ambrofix?

生物技術(shù)公司Amyris成功開發(fā)了利用改性酵母的生物技術(shù)制造工藝，生物基(E)-β-金合歡烯已成為一種商品化學(xué)品。在釀酒酵母中，(E)-β-金合歡烯通過(guò)黃花蒿金合歡烯合酶的異源表達(dá)由金合歡基二磷酸(FPP)產(chǎn)生?？山邮艿纳a(chǎn)力要求金合歡烯合酶的異源表達(dá)和內(nèi)源性甲羥戊酸途徑酶的過(guò)度表達(dá)，以持續(xù)向酵母提供金合歡基二磷酸(FPP)。從培養(yǎng)液中分離出來(lái)的高濃度(E)-β-金合歡烯可被釀酒酵母所耐受，從而具有良好的生產(chǎn)力（對(duì)于100 g葡萄糖，高達(dá)23.8 g（(E)-β-金合歡烯）。[26](E)-β-金合歡烯因此可以通過(guò)末端雙鍵的化學(xué)選擇性和立體特異性環(huán)丙烷化，然后在水中通過(guò)Bronsted酸催化開環(huán)，分兩步化學(xué)轉(zhuǎn)化為(E,E)-均金合歡醇。[28](E,E)-均金合歡醇然后通過(guò)角鯊烯-霍普烯環(huán)化酶（SHC）酶環(huán)化為(-)-龍涎呋喃(Ambrofix?)，該酶可由微生物分離或異源表達(dá)（方案5）。[29]可以通過(guò)隨機(jī)誘變優(yōu)化產(chǎn)自酸乳桿菌的SHC，表達(dá)SHC變體的大腸桿菌菌株，使高達(dá)188 g/L(E,E)-均金合歡醇在SDS作為表面活性劑存在的最小72小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化。[30]

方案5.(E,E)-均金合歡醇通過(guò)角鯊烯-霍普烯環(huán)化酶（SHC）環(huán)化成(-)-龍涎呋喃。

同樣，巴斯夫的一項(xiàng)專利提到了一種均金合歡醇龍涎香烷環(huán)化酶，它可以從檸檬醛中得到(-)-降龍涎醚?。[31]

龍涎縮醛(amber oxepin)（又名amberketal）商標(biāo)為Z11?[32]，在生物技術(shù)香料成分組合中是獨(dú)一無(wú)二的，因?yàn)樗畛跏?0年代發(fā)現(xiàn)的一種人工成分，當(dāng)時(shí)進(jìn)行大量的合成工作來(lái)完成的龍涎香致香分子。龍涎縮醛可從香紫蘇醇、淚杉醇或香紫蘇醇氧化物中發(fā)酵得到，然后經(jīng)過(guò)清潔氧化和縮醛生成。因此，它是以生物為基礎(chǔ)的，過(guò)程是可持續(xù)的，但不能被認(rèn)為是自然的。

深冬烯Zizaene

香根草精油是通過(guò)對(duì)海地、印度尼西亞、巴西、留尼汪島或斯里蘭卡的香根草進(jìn)行水蒸餾而獲得的，是一種珍貴的天然成分，具有木香、壤香、琥珀香的香氣。分析化學(xué)家認(rèn)為它是使用的香料中最復(fù)雜的天然物質(zhì)之一。[33]香根草精油中的幾種氣味影響成分具有共同的深冬烷骨架，例如深冬酮、深冬醇、深冬-3-醇、和表-2-深冬烯-6(13)-烯-3-酮，見（方案6）。[34]

參與香根草中的(+)-深冬烯萜烯合酶已與甲羥戊酸鹽途徑相關(guān)的基因一起轉(zhuǎn)移到重組大腸桿菌中。[35]因此，可以提出將葡萄糖的工程化全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化直接轉(zhuǎn)化為(+)-深冬烯。改性大腸桿菌菌株在兩相DNB發(fā)酵液/異辛烷中進(jìn)行發(fā)酵，并在優(yōu)化條件下輸送高達(dá)25 mg/L(+)-深冬烯（由10%的β-菖蒲二烯形成），初始進(jìn)料為5 g/L葡萄糖。

最近獲得了一項(xiàng)專利，可通過(guò)發(fā)酵進(jìn)一步經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)有機(jī)合成得到5-表-β-香根草酮和相關(guān)致香成分，從而獲得豆腐柴螺二烯（一種螺旋二烯倍半萜）。[36] β-香根草酮是一種具有螺癸烷骨架的成分，是香根草精油香氣中的一種貢獻(xiàn)成分，具有果香和木香香氣。

方案6. 來(lái)自參考文獻(xiàn)[34]，香根草精油中發(fā)現(xiàn)的具有深冬烷骨架的香氣影響分子

諾卡酮Nootkatone

含氧倍半萜諾卡酮是香根草和柑橘精油的一種成分，在葡萄柚香氣方面起著重要作用，通常與乙酸香根草酯有關(guān)。[34]巴倫西亞橙（Citrus x sinensis Valencia）精油中的倍半萜碳?xì)浠衔锿邆愊┛赏ㄟ^(guò)化學(xué)選擇性氧化得到諾卡酮。一個(gè)編碼瓦倫烯合成酶的基因可在重組細(xì)菌細(xì)胞中異源表達(dá)，并允許通過(guò)濃度高達(dá)356 g/L的金合歡醇二磷酸從碳源（如葡萄糖）生產(chǎn)瓦倫烯。[37]（生物）化學(xué)氧化可將瓦倫烯轉(zhuǎn)化為諾卡酮，已知酶反應(yīng)可選擇性地提供所需的異構(gòu)體（方案7）。[38]

最近，月桂烯等單萜烯烴也吸引了生物技術(shù)公司的興趣。[39]從羅勒屬植物和香葉基二磷酸鹽中克隆出一種月桂烯合酶，從冬青櫟、大冷杉、金魚草、擬南芥、粗山羊草屬植物、石蒜科六出花或歐洲云杉中克隆出一種香葉基二磷酸合酶，并在微生物重組有機(jī)體中表達(dá)，以產(chǎn)生月桂烯，以及其他萜烯，如α-和γ-萜烯，來(lái)自碳源，如單糖（如葡萄糖）、雙糖（如蔗糖）或不可發(fā)酵碳源（甘油）。雖然月桂烯本身在嗅覺上并不引人關(guān)注，但生物基月桂烯可以轉(zhuǎn)化為各種有價(jià)值的產(chǎn)品，從而部分或完全生物基化。

方案7. 從葡萄糖到諾卡酮的生物催化途徑。

在另一項(xiàng)專利申請(qǐng)中聲稱，用編碼整個(gè)甲羥戊酸途徑的基因和所選萜烯合酶轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞可將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為香茅醛和香茅醇。[40]

麝香酮Muscone

除萜烯類外，還利用重組生物制備了麝香酮等大環(huán)化合物，動(dòng)物原料麝香、麝香酮和麝香酮的氣味原理。[41]L-異亮氨酸被用作前體，為甲基取代的不對(duì)稱碳原子提供了正確的絕對(duì)構(gòu)型。在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化為(S)-2-氧代戊酸-3-甲酯。

轉(zhuǎn)酮酶活性傳遞(S)-2-甲基丁醛，進(jìn)一步氧化為(S)-2-甲基丁酸，硫酯化為(S)-2-甲基丁酸輔酶A。

然后，后者通過(guò)脂肪酸合成酶結(jié)合到(S)-反異脂肪酸生物合成中，導(dǎo)致14、16或18個(gè)碳原子鏈。末端位置的氧化產(chǎn)生相應(yīng)的二元酸，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其二元酸輔酶A并環(huán)化為麝香酮，可能通過(guò)環(huán)縮合/水解/脫羧（方案8）。

方案8. (R)-麝香酮的多步生物催化合成。

(Z)-3-己烯-1-醇(Z)-hex-3-en-1-ol

草青香氣中的典型致香分子為(Z)-3-己烯-1-醇。開發(fā)了一種從亞麻酸（來(lái)自大豆粉）中提取13-脂氧合酶（LOX）和13-過(guò)氧化氫裂解酶（HPL）的生物技術(shù)方法，以獲得(Z)-3-己烯-1-醛，進(jìn)一步還原為(Z)-3-己烯-1-醇。通過(guò)定向進(jìn)化提高了從番石榴（番石榴）中分離的13-過(guò)氧化氫裂解酶的性能。經(jīng)過(guò)四個(gè)周期的基因改組和隨機(jī)突變，預(yù)期的產(chǎn)品產(chǎn)量增加了15倍。[42]

檀香醇Santalol

繼對(duì)桑塔烯合酶的研究（見上文）之后，巴斯夫于2020年7月收購(gòu)Isobionics后向市場(chǎng)提供了一種可再生的生物技術(shù)桑塔洛爾。[43]

食用香料Flavors

由生物技術(shù)生產(chǎn)的天然等級(jí)的食用香料在市場(chǎng)上存在時(shí)間比香水中的日用香料成分要長(zhǎng)。

因此，考慮到天然香蘭素與合成香蘭素相比的市場(chǎng)價(jià)格以及供應(yīng)的不穩(wěn)定性，生物技術(shù)生產(chǎn)的天然香蘭素，無(wú)論是在全細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程中還是在分離酶中，仍然是一個(gè)熱門目標(biāo)。[44]從天然和可用的起始材料，如阿魏酸[45]、丁香酚[46]、和姜黃素，開發(fā)了幾種路線。[47]經(jīng)過(guò)多種酶工程的重組微生物現(xiàn)在能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為香蘭素和香蘭素β-D-葡萄糖苷，后者對(duì)微生物毒性較小。[48]其他帶有水果香氣的天然香料，如呋喃酮（草莓香氣）和羥苯基丁酮（覆盆子香氣），是最近研究開發(fā)可行生物技術(shù)路線的重點(diǎn)。

用分離酶優(yōu)化天然復(fù)合物

如果整個(gè)細(xì)胞過(guò)程對(duì)于多步合成和明顯的從頭合成特別有效，當(dāng)只需要一個(gè)反應(yīng)來(lái)轉(zhuǎn)化現(xiàn)成的起始材料時(shí)，分離酶可能是更好的選擇。固定化技術(shù)有很多種，酶可以附著在幾乎任何類型的載體上（有機(jī)、礦物、疏水、親水、天然、合成、磁性……），允許其回收和再循環(huán)或在連續(xù)過(guò)程中使用。[51]另一方面，考慮到酶的底物特異性，它們已被用于與天然復(fù)合物（NCS）中單一化合物或有限數(shù)量的常見化學(xué)類別的化合物反應(yīng)。因此，可以通過(guò)對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行受控、特定和選擇性的酶改性來(lái)優(yōu)化天然復(fù)合物的性質(zhì)。

香根草精油Vetiver essential oil

香根草精油（VEO）是一種重要的天然香料原料（見上文）。市場(chǎng)上可以找到幾種來(lái)源，也可以找到幾種特別產(chǎn)物，如具有某些特定嗅覺特征的分子蒸餾餾分、乙?；苌锘騼烧叩慕M合。富含倍半萜醇的粗香根草精油或分餾香根草精油確實(shí)可以進(jìn)行乙酰化反應(yīng)，以提供各種質(zhì)量的乙酸香根草酯。乙酸香根草酯是一種仍然屬于木香家族的致香成分，但具有琥珀和葡萄柚的香氣，壤香較少。

乙酸香根草酯通常是通過(guò)在催化劑存在或不存在的情況下，在溶劑中，加熱后將香根草精油或香根草精油輕餾分與醋酸酐進(jìn)行乙?；@得，并歸類為合成成分。

利用南極洲假絲酵母脂肪酶B的大底物混雜性，以天然乙酸乙酯為溶劑和酰基供體，通過(guò)酶乙酰化制備了香根草乙酸酯。[53]在這一過(guò)程中，由于所用的酶固定在丙烯酸樹脂上，可循環(huán)使用12次以上，且活性幾乎沒有下降，因此獲得了非常高的可持續(xù)性，使用生物基乙酸乙酯并在蒸發(fā)后循環(huán)使用，反應(yīng)在室溫下幾小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。因此，首次以定量產(chǎn)量和千克規(guī)模生產(chǎn)出95%以上的天然乙酸香根草酯。有趣的是，詳細(xì)全面的GCxGC-MS表明，該反應(yīng)與伯倍半萜醇發(fā)生化學(xué)選擇性反應(yīng)，留下的仲醇和叔醇大部分保持不變。

橡苔凈油Oakmoss absolute

橡苔凈油是地衣橡苔(Evernia prunastri)的溶劑提取物，也是一種天然原料，近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，在素心蘭和馥奇香韻中一直用于制作精細(xì)香料。[54]橡苔凈油主要由單芳香化合物和縮酚酸類化合物組成，含有少量接觸性過(guò)敏原苔黑醛和氯化苔黑醛。2017年8月2日歐盟（EU）委員會(huì)第2017/1410號(hào)條例規(guī)定，自2021 8月23日起，不得在歐盟市場(chǎng)上提供含有這些物質(zhì)的化妝品。[11]

根據(jù)我們之前對(duì)丁香酚的研究，我們開發(fā)了一種基于過(guò)氧化物酶的策略，專門從橡苔凈油中去苔黑醛和氯化苔黑醛。[56]連續(xù)過(guò)程中的反應(yīng)是，兩種芳香醛在pH為9的條件下通過(guò)過(guò)氧化氫進(jìn)行Dakin氧化，然后在同一罐中通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶HRP催化產(chǎn)生的鄰苯三酚衍生物進(jìn)行氧化偶聯(lián)（方案9）。在這些氧化條件下，提出了一種由酶氧化開始的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以解釋所形成產(chǎn)物的復(fù)雜性。[56a]該產(chǎn)品為水溶性產(chǎn)品，可通過(guò)液-液萃取簡(jiǎn)單地從凈油中去除。

結(jié)果顯示，改良后的橡苔凈油中的苔黑醛和氯化苔黑醛含量?jī)H為ppm。通過(guò)對(duì)56人的小組進(jìn)行三角測(cè)試進(jìn)行感官分析，結(jié)果表明，在99%置信水平下，無(wú)苔黑醛的凈油從嗅覺角度來(lái)看，與真實(shí)凈油沒有顯著差異。

方案9. 苔黑醛氧化為5-甲基鄰苯三酚，通過(guò)HRP觸發(fā)的氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成稠合二聚體。

可持續(xù)性和天然性

生物催化是“自然”可持續(xù)的。[57]這不僅是因?yàn)榉磻?yīng)是在水中進(jìn)行的（而且在下游加工過(guò)程中有時(shí)需要溶劑來(lái)收集產(chǎn)品），而且是在接近室溫的溫度下進(jìn)行的，還有許多其他方面的原因?？紤]到著名的12條原則所指的綠色和可持續(xù)化學(xué)的4個(gè)主要項(xiàng)目，[58]可以列出以下可持續(xù)性應(yīng)用生物催化的資產(chǎn)：

廢物預(yù)防

-高選擇性，僅提供所需產(chǎn)品（副產(chǎn)品較少）；

-高對(duì)映選擇性，能夠僅提供活性立體異構(gòu)體，包括對(duì)映體重要的情況。這在芳香化學(xué)中尤其重要，因?yàn)槭中院苤匾?，可能?huì)對(duì)氣味分子的性質(zhì)產(chǎn)生定性和定量的影響；[59]

-節(jié)約型，生物催化過(guò)程在添加劑、活化劑、保護(hù)基團(tuán)等方面的有限要求，主要?dú)w功于酶的高度特異性；

-天然等同分子的生物降解性，其降解生物化學(xué)級(jí)聯(lián)已經(jīng)存在或很容易被活生物體激活。

資源

-使用的酶是穩(wěn)定的可再生生物催化劑，而不是石化化學(xué)試劑，因此消耗資源，有時(shí)保質(zhì)期有限；

-當(dāng)估計(jì)生物量的50%由碳水化合物組成時(shí)，葡萄糖可以用作碳源；

-通常從天然基質(zhì)或生物基質(zhì)開始。

安全

-水作為一種不易燃、無(wú)毒的溶劑，不存在放大的風(fēng)險(xiǎn)。然而，工業(yè)廢水在排放前需要進(jìn)行處理，主要是為了去除微生物病原體和重金屬。

-很少需要外部安全；

-除過(guò)敏性外，在處理過(guò)程中或接觸時(shí)，酶不被視為有害物質(zhì)；

-無(wú)需特殊安全工藝的高壓/高溫、自燃或含能材料。

有限的監(jiān)督

-使用生物技術(shù)方法去除被標(biāo)記為健康問(wèn)題的特定管制化合物可以提高投放市場(chǎng)的產(chǎn)品的安全性。

有力的節(jié)制

-室溫工藝，意味著沒有加熱或冷卻，這在工業(yè)上是昂貴的操作。

度量標(biāo)準(zhǔn)

用單一指標(biāo)衡量所有這些因素和影響并非易事。一般來(lái)說(shuō)，考慮同質(zhì)的影響組，并以相對(duì)方法而非絕對(duì)方法比較成分或過(guò)程，更方便、更具洞察力。[61]一些倡議在行業(yè)內(nèi)蓬勃發(fā)展，以在其活動(dòng)中實(shí)施和衡量可持續(xù)性，或多或少側(cè)重于與綠色化學(xué)直接相關(guān)的概念。法國(guó)Mane et fils公司在2010年初開發(fā)了綠色運(yùn)動(dòng)指標(biāo)[62]，該指標(biāo)基于0-100分制的對(duì)制造成分的健康、安全和環(huán)境影響的評(píng)估。

在法國(guó)，創(chuàng)新集群PASS（現(xiàn)為Innov'Alliance）于2018年與香料行業(yè)的12家公司建立了生態(tài)責(zé)任成分標(biāo)簽（ERI-360）。[63]通過(guò)對(duì)農(nóng)業(yè)和制造過(guò)程以及社會(huì)方面的分析，可以將標(biāo)簽歸因于不同程度的生態(tài)責(zé)任。2018年，德之馨開發(fā)了產(chǎn)品可持續(xù)性記分卡，以評(píng)估其解決方案的可持續(xù)性[64]和IFF“邁向循環(huán)未來(lái)”計(jì)劃。[65]

2019年，奇華頓啟動(dòng)了“五碳之路”(FiveCarbon Path?)，作為“明天感”計(jì)劃的一部分，旨在增加可再生碳的使用，提高合成中的碳效率，最大限度地提高可生物降解碳，使用高抗沖擊材料提高“每碳?xì)馕侗取保⑹褂脕?lái)自側(cè)流的向上循環(huán)的碳。[66]

繼2018年推出“生態(tài)氣味指南”(EcoScent Compass)之后，芬美意公司宣布于2020年6月推出“生態(tài)成分指南”(EcoComponent Compass)，這是一種新的專有工具，用于即時(shí)評(píng)估芳香分子的可再生碳、生物降解性和綠色化學(xué)。[67]

社會(huì)

綠色化學(xué)的十二項(xiàng)原則并沒有真正解決社會(huì)影響，除了作為安全問(wèn)題在全球范圍內(nèi)解決的健康問(wèn)題。生物多樣性可能因大量消耗特定的植物或動(dòng)物資源而受到威脅。如果出于道德原因，動(dòng)物源性成分如今很少使用，那么一些珍貴的有氣味的木材，在過(guò)去幾十年中被大量開發(fā)，現(xiàn)在已被置于國(guó)際公約（如CITES）的保護(hù)之下，以避免其滅絕。消費(fèi)者可能對(duì)其生活方式的這些類型的影響很敏感。

代謝工程和合成生物學(xué)等新技術(shù)對(duì)非洲或其他地方發(fā)展中國(guó)家財(cái)富的影響是一些非政府組織關(guān)注的問(wèn)題。[68]例如，香草種植和出口是馬達(dá)加斯加的重要經(jīng)濟(jì)資產(chǎn)，2018年占全球香草總市場(chǎng)的62%。香精香料行業(yè)的大多數(shù)大公司在可持續(xù)發(fā)展計(jì)劃中都考慮到了這一點(diǎn)，以同時(shí)提高農(nóng)民收入和農(nóng)業(yè)實(shí)踐。2020年夏季，IFRA和IOFI發(fā)布了IFRA-IOFI可持續(xù)發(fā)展憲章。[69]

經(jīng)濟(jì)可行性

與傳統(tǒng)工藝相比，白色生物技術(shù)工藝的經(jīng)濟(jì)可行性問(wèn)題是合理的，尤其是在產(chǎn)品濃度和生產(chǎn)率較低的情況下，并且在評(píng)估其工業(yè)實(shí)施情況時(shí)始終至關(guān)重要。[70]

對(duì)于商品化學(xué)品，銷售價(jià)格取決于原油價(jià)格的變化，[71]對(duì)于包括香料成分在內(nèi)的精細(xì)化學(xué)品，則取決于關(guān)鍵中間體的短缺問(wèn)題。[72]

如果我們考慮工業(yè)生物技術(shù)可行性的一般方面，我們可以大致按增值過(guò)程遞減順序確定3類化學(xué)品：原料藥、精細(xì)化學(xué)品、中間體和商品。在過(guò)去二十年中，工業(yè)上越來(lái)越多地實(shí)施生物技術(shù)工藝，最終產(chǎn)生了非常有價(jià)值的手性原料藥，如西他列汀[73]（在優(yōu)化的最終工藝中，酶可以耐受200g/L濃度的底物），總收率提高（13?%）和生產(chǎn)力（53?%）與化學(xué)過(guò)程（過(guò)渡金屬基不對(duì)稱催化）相比。研究了生物基商品的最低售價(jià)（MSP），并確定與傳統(tǒng)的石化生產(chǎn)工藝相比，有效量≥45g/L可降低生產(chǎn)成本、能耗和溫室氣體排放。[74]

在香精成分的特殊情況下，它取決于成分和策略，當(dāng)一種成分可以保持受控狀態(tài)時(shí)（非商用，僅用于擁有它的香料公司的香水成分中，并用作識(shí)別標(biāo)志）。在某些特定情況下，它還取決于天然成分價(jià)格的變化。

天然性

從孟德爾的人工植物雜交[75]到代謝工程和分子工具的基因選擇和編輯[76]，我們應(yīng)該如何根據(jù)科學(xué)輸入定義自然性？這些領(lǐng)域正在迅速擴(kuò)展，通過(guò)實(shí)施組學(xué)、硅模擬和深度學(xué)習(xí)算法，加快生物成分的選擇、組裝和協(xié)調(diào)，以實(shí)現(xiàn)從廉價(jià)元素來(lái)源生物合成有價(jià)值的化學(xué)品。另一方面，消費(fèi)者認(rèn)為精油是高度天然的物質(zhì)，盡管在潮濕條件下100°C加熱萜烯是進(jìn)行水合、脫水和異構(gòu)化反應(yīng)等的合適方式。人工的定義更簡(jiǎn)單：在自然界中從未見過(guò)，因此是由人類大腦設(shè)計(jì)的。然而，如果一種化合物后來(lái)在自然界中被發(fā)現(xiàn)，那么它的人工狀態(tài)可能會(huì)發(fā)生變化。自然界中相同的分子應(yīng)該享有特殊的地位，因?yàn)樗鼈冊(cè)诖x組中的存在具有進(jìn)化的合理性，并且因?yàn)樽匀唤缰廊绾翁幚磉@些分子，并最終處理這些分子。

自然界中未知但在涉及轉(zhuǎn)基因的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的分子的狀態(tài)仍然是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。盡管經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因改性，但轉(zhuǎn)基因生物仍然是活的有機(jī)體，其任何代謝產(chǎn)物都應(yīng)被視為天然產(chǎn)物。Clearwood?和Akigalawood?等成分是臨界物質(zhì)的很好例子，可以它們的自然性被證明。前者由轉(zhuǎn)基因活生物體制成，但產(chǎn)生了自然界其他地方從未見過(guò)的代謝物；后者是一種人造成分，使用酶從天然原料制備而成，雖然天然，但幾乎不應(yīng)將其視為活的生物體。由于具有幾乎無(wú)限的能力來(lái)改變細(xì)菌宿主的代謝，這最終意味著任何分子都應(yīng)該是白色生物技術(shù)“天然”制造的，因此“天然分子”一詞將失去意義。擠壓柑橘類水果并聞其氣味可能是聞到真正天然氣味的最可靠方法。

觀點(diǎn)

生物技術(shù)工藝在香料行業(yè)的應(yīng)用以及最近推出的香料成分的成功無(wú)疑表明，該領(lǐng)域在未來(lái)將繼續(xù)增長(zhǎng)。這些方法不僅積極平衡了世界偏遠(yuǎn)地區(qū)生產(chǎn)的原材料供應(yīng)問(wèn)題，有時(shí)還受到外部因素（氣候變化、自然災(zāi)害、政治變化、短缺……）的影響，但這些工藝也符合對(duì)可持續(xù)成分和工藝日益增長(zhǎng)的需求。如果這些高科技的基因科學(xué)操作似乎保留給大公司，那么用于轉(zhuǎn)移、表達(dá)和純化的基因編輯工具和配件的普及必將在不久的將來(lái)允許在該領(lǐng)域得到更大的應(yīng)用。專門從事這類活動(dòng)的小公司也在這方面與F&F公司建立了合資企業(yè)。

在Gingko生物工程提交的上述專利中，通過(guò)選擇稀有或已滅絕植物DNA中的部分基因構(gòu)建了嵌合萜烯合成酶。[18] 這種方法可能導(dǎo)致前所未有的生物合成步驟組合，從而產(chǎn)生新的倍半萜結(jié)構(gòu)或倍半萜衍生物的原始混合物。

然而，轉(zhuǎn)基因生物的問(wèn)題對(duì)某些企業(yè)和產(chǎn)品仍然很敏感，一些終端消費(fèi)者不愿意接觸轉(zhuǎn)基因生物或通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因生物獲得的產(chǎn)品，有時(shí)對(duì)實(shí)際發(fā)生的事情缺乏了解。此外，在環(huán)境中意外釋放的轉(zhuǎn)基因生物可能會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生無(wú)法控制的影響。這個(gè)問(wèn)題必將影響代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域的未來(lái)。另一種解決方案是使用野生酶，即使研發(fā)和開發(fā)階段仍然可以使用異源表達(dá)產(chǎn)生的酶，并使用外部方法而不是基因操作來(lái)達(dá)到目標(biāo)反應(yīng)性：底物濫交、催化濫交和媒介濫交，研究實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究了多年。[52, 77]

生物技術(shù)可以與更好地理解人類嗅覺系統(tǒng)一起使用，通過(guò)刺激大約400個(gè)人類嗅覺受體來(lái)重建自然香氣特征。[78]

考慮到自然性的難以定義，在未來(lái)可能僅限于未加工物質(zhì)，因此不應(yīng)低估監(jiān)管機(jī)構(gòu)在這一領(lǐng)域的影響。