香精與香料(58)—呋喃酮

呋喃酮是一種香味增效劑，化學式為C6H8O3。外觀為白色至淺黃色固體，呈強烈的焦糖香氣，同時具有濃郁的水果香味及果醬味，稀釋后具有覆盆子香味。易被空氣氧化，商品以丙二醇稀釋儲存，其香味在弱酸介質中尤為濃厚。天然品存在于菠蘿、草莓、葡萄、咖啡、芒果、加熱牛肉湯、葡萄酒等之中。微量存在于食品、煙草、飲料中，香味閾值為0.04ppb就具有明顯的增香修飾效果，因而廣泛用作食品、煙草、飲料的增香劑；呋喃酮雖然廣泛存在于天然產(chǎn)物中，但由于其含量很低，不能滿足日常所需，食品行業(yè)所用的多為合成產(chǎn)品。

呋喃酮

GB 2760－2011規(guī)定為可用于食品香料?？蓮V泛用于食品，飲料以及日化產(chǎn)品中，使美國使用香料協(xié)會(FEMA)(登記號：3174)和歐洲香料理事會(文號：536)認可的使用安全香料。

使用限量：FEMA(mg/kg)：冰淇淋、明膠和布丁，5.0；糖果，焙烤制品，10.0；含醇飲料，60。

草莓酮

中文名 呋喃酮

外文名 Furaneol; Strawberry furanone; 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3-(2H)-furanone; DMHF

別    名4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮；呋喃酮醇；菠蘿酮；草莓酮

化學式 C6H8O3

分子量 128.13

CAS號 3658-77-3

熔    點 73 至 77 ℃

沸    點 188 ℃

水溶性 微溶

密    度 1.049 g/cm3(25℃)

外    觀 白色至淺黃色結晶體或粉末狀固體。具有強烈的焙烤焦糖香味，特征香氣為果香、焦香、焦糖和菠蘿樣香氣

閃    點 230 ℉(以上)

應    用 可用于食品香料

FEMA 3174

呋喃酮的生物合成

1、呋喃酮在草莓中的合成假說

圖1 草莓果實中呋喃酮生物合成途徑的假設。4-Hydroxy-5-methyl-2-methylene-3 (2H) -furanone HMMF;4-hydroxy-2, 5 - dimethyl-3 (2 h) -furanone HDMF;草莓醌氧化還原酶(FaQR);F. x ananassa烯酮氧化還原酶FaEO;F. x ananassa o -甲基轉移酶FaOMT。[1]

然后，對參與HDMF生物合成的一種酶進行部分純化。觀察到的酶活性分布與單一多肽的存在有關。序列分析表明，該酶與一個成熟誘導的生長素依賴性醌氧化還原酶(FaQR)的蛋白序列完全一致。FaQR蛋白在大腸桿菌中功能表達，并催化HDMF的形成。4-羥基-5-甲基-2-亞甲基-3(2H)-呋喃酮(HMMF)被鑒定為FaQR的天然底物和HDMF的前體(圖1)。[1]

FaQR催化高反應性烯酮HMMF的α、β不飽和鍵的還原，后來更名為F. x ananassa烯酮氧化還原酶(FaEO)。FaEO并沒有還原直鏈2-烯醛和2-烯醛的雙鍵，而是使亞甲基官能團取代的一些HMMF衍生物發(fā)生氫化反應。在番茄和菠蘿果實中也檢測到HMMF，表明HDMF在不同果實中通過相似的途徑合成。從cDNA中克隆類番茄茄EO (Solanum lycopersicon EO, SlEO)，并對重組蛋白進行了鑒定。生化研究證實，SlEO參與了番茄果實中HDMF的形成。與其他兩種依賴NAD(P)H的非黃素烯還原酶相比，F(xiàn)aEO和SlEO表現(xiàn)出較窄的底物光譜。直到最近，為了闡明FaEO催化的特殊反應的分子機理，才確定了它在六種不同狀態(tài)或配合物中的晶體結構，包括與HDMF以及與三種底物類似物的配合物。結果表明，NAD(P)H的4R-氫化物被轉移到HMMF的不飽和外環(huán)C-6碳上，形成環(huán)旋光不活躍的烯醇中間體，然后發(fā)生質子化反應生成HDMF。[1]

值得注意的是，一些報告表明，呋喃酮的產(chǎn)生可能不是一種植物代謝途徑的直接活動，而是草莓植物和一種相關的細菌——扭脫甲基桿菌的共同努力。然而，這一提議的路線并不令人信服，因為關于HDMF和DMMF的最終步驟的報道相互矛盾，示蹤實驗也不支持提議的中間產(chǎn)物乳糖和6-脫氧-D -果糖-1-磷酸轉化為呋喃酮。[1]

2、酵母合成呋喃酮

作為發(fā)酵醬油的主要風味成分，HEMF首次從發(fā)酵醬油中分離出來。在含有基于核糖和甘氨酸的氨基羰基(美拉德)反應產(chǎn)物的培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)耐鹽酵母，魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)，促進了HEMF的形成。利用化合物的穩(wěn)定同位素對其機理進行了研究。HEMF的五元環(huán)骨架和側鏈甲基來源于核糖，乙基來源于D-葡萄糖或乙醛。酵母在HEMF形成過程中的作用不僅是提供d -葡萄糖代謝物(乙醛)，而且是將美拉德反應物與D-葡萄糖代謝物結合。[1]

在魯氏接合酵母的細胞質提取物中，經(jīng)與一些磷酸鹽碳水化合物孵育后，發(fā)現(xiàn)HMF的形成。由于HMF是由核酮糖-5-磷酸通過美拉德中間體4,5-二羥基-2,3-戊二酮自發(fā)形成的，因此可以假設核酮糖-5-磷酸是在胞質提取物中酶促生成的，然后通過化學反應轉化為HMF。這一假設通過在含有市場上可獲得的酶和同位素標記的D-葡萄糖-6-磷酸的混合物中生產(chǎn)羥甲基糠醛得到了證實。有趣的是，HMF已被鑒定為由LuxS酶催化的胞外信號分子Al-2，并在細菌細胞間通訊中發(fā)揮作用。由5-磷酸核酮糖形成的Al-2的化學形成也可能發(fā)生在體內(nèi)，這可能是缺乏luxS基因的生物體中Al-2樣活性的原因。[1]

以D-1,6-二磷酸果糖為原料，研究了魯氏接合酵母(Z. rouxii)在不同培養(yǎng)條件下形成HDMF的過程。當D-1,6-二磷酸果糖作為唯一碳源時，魯氏接合酵母(Z. rouxii)的生長和HDMF的形成不明顯。雖然魯氏接合酵母(Z. rouxii)細胞生長在以D-葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，但HDMF僅在添加D-果糖-1,6-二磷酸時產(chǎn)生。HDMF水平始終與酵母細胞數(shù)和D-果糖-1,6-二磷酸鹽濃度相關。添加1-13C-D-果糖-1,6-二磷酸后只形成單標記的HDMF，而添加13C6-D-葡萄糖后形成未標記的呋喃酮。因此，HDMF的碳完全來源于外源性的D-果糖-1,6-二磷酸。較高的培養(yǎng)基pH值對HDMF的形成有積極的影響，但會延緩細胞的生長，因此最適pH值為5.1。鹽脅迫刺激了HDMF的產(chǎn)生。向培養(yǎng)基中添加鄰苯二胺(α-二羰基(美拉德)中間體的捕獲試劑)，可以得到3個由D-果糖-1,6-二磷酸衍生的喹惡啉衍生物。該結構的鑒定首次證實了1-脫氧-2,3-己二糖-6-磷酸的化學形成，這是一種普遍預期但從未發(fā)現(xiàn)的HDMF形成途徑的中間體。由于HDMF僅在Z. rouxii細胞存在的情況下被檢測到，因此假設有更多的酶的步驟。在環(huán)境溫度下，HDMF也可以在含有D-果糖-1,6-二磷酸和NAD(P)H的溶液中化學生成。NAD(P)H是必須的，而標記前體的應用表明D-果糖-1,6-二磷酸骨架的氫化物轉移到C-5或C-6。從D-果糖-1,6-二磷酸生成HDMF的生物和化學過程似乎遵循類似的途徑。[1]

具有光學活性的天然產(chǎn)物在生物合成過程中由于立體選擇性、酶催化反應而表現(xiàn)出特有的對映體過剩。雖然通過魯氏接合酵母(Z. rouxii)和水果酶促生成HDMF是預期的，自然產(chǎn)生的化合物是外消旋的。由于酮烯醇互變異構，HDMF的快速外消旋化解釋了這一現(xiàn)象。通過對C-2上呋喃酮環(huán)上的質子與氘交換的1H-NMR和手性相毛細管電泳分析表明，在pH值為4~5時，HDMF的外消旋化率最低。因此，為了驗證HDMF的酶促形成，我們在pH為5的條件下，用魯氏接合酵母(Z. rouxii)和草莓蛋白提取物進行了孵育實驗。在兩個實驗中都證實了對映體富集的HDMF的形成，而在中性pH條件下檢測到外消旋呋喃酮。[1]

3、細菌合成呋喃酮

在含有L-鼠李糖的酪蛋白蛋白胨培養(yǎng)基上，莢膜畢赤酵母(Pichia capsulata )生長4 d后檢測HDMF。穩(wěn)定同位素比值質譜分析證實了L-鼠李糖是HDMF的碳源。時間過程實驗導致假設，HDMF是由莢膜畢赤酵母在培養(yǎng)基熱滅菌過程中產(chǎn)生的中間體形成的，正如魯氏接合酵母所提出的。同樣，在美拉德反應的結果中，HDMF在加熱糖和氨基酸制備的介質中被檢測到。而在相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，HDMF水平被乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris.)發(fā)酵也有所提高。[1]

4、有關呋喃酮的合成的小結

3(2H)-呋喃酮類化合物具有低的氣味閾值和誘人的香味特性，是重要的芳香化學物質。它們是由不同的碳水化合物在美拉德反應過程中化學形成的，因此在許多加工食品中都存在，它們有助于產(chǎn)生香味。但呋喃酮也可由酵母、細菌和植物產(chǎn)生，其生理功能可能與氧化還原活性有關。雖然像L-鼠李糖這樣的脫氧糖是美拉德反應中HDMF的有效前體，但D-1,6-二磷酸果糖被鑒定為水果中的天然前體。在草莓果實中，磷酸化的碳水化合物被磷酸鹽和水分消除作用轉化為HMMF, HMMF最終被FaEO (FaQR)還原為HDMF。HDMF的甲基化作用導致DMMF的積累，并由FaOMT催化?？偟膩碚f，由于同位素標記前體的應用，在闡明微生物和植物中天然呋喃酮的生物合成途徑方面取得了重大進展。在不久的將來，對林地草莓基因組序列的了解將有助于檢測HDMF通路缺失的基因，改進的成像系統(tǒng)將有助于定位細胞內(nèi)呋喃酮。對相關基因和酶的了解將為生物技術生產(chǎn)天然呋喃酮提供基礎。[1]

呋喃酮的生物與藥理活性

1、呋喃酮對人體病原菌和真菌的抑菌作用

呋喃酮是在草莓、菠蘿和加工食品中發(fā)現(xiàn)的一種重要的芳香化合物，已知在動物模型上具有多種生物活性。本研究探討了呋喃酮對人體病原微生物的抑菌作用。結果表明，呋喃酮對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌及真菌具有廣譜抗菌活性，且對人紅細胞無溶血作用。為了證實呋喃酮的抗真菌活性，我們研究了細胞內(nèi)海藻糖的積累作為毒性物質的應激反應標記物及其對白色念珠菌二形轉變的影響。結果表明，呋喃酮誘導細胞內(nèi)海藻糖的大量積累，并通過破壞血清誘導的菌絲形態(tài)發(fā)揮其抗真菌作用。這些結果表明，呋喃酮可能是一種對人類致病微生物具有廣譜抗菌活性的治療劑。[2]

2、關鍵食物呋喃酮(Furaneol, 4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮)和索托酮(Sotolone, 3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮)特異激活不同的氣味受體

在美拉德反應中形成的呋喃酮通常是天然的芳香關鍵化合物，存在于許多食物中。在經(jīng)濟上具有重要意義的是結構同構物呋喃酮和索托酮，它們具有獨特的焦糖和調味風味，是重要的天然香料化合物。然而，這并不能通過氣味分子的形狀來預測，相反，它們受體的激活參數(shù)可以幫助解碼氣味質量的編碼。在這里，呋喃酮和索托酮的獨特氣味特性表明，在我們大約400種不同的氣味受體類型中，至少有兩種被激活，它們是我們化學嗅覺的分子生物傳感器。當一種氣味受體已被確定為索托酮，一種受體特異性呋喃酮尚不清楚。在一項基于HEK-293細胞的發(fā)光試驗中，我們采用了一種雙向篩選的方法，使用616個受體變異和187個關鍵的食物氣味，我們新發(fā)現(xiàn)OR5M3是一種被呋喃酮和醬油酮(Homofuraneol, 5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮)特異性激活的受體。[3]

OR5M3是一種被呋喃酮和醬油酮(Homofuraneol, 5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮)特異性激活的受體。[3]

3、呋喃酮骨架的化學和藥理潛力綜述

呋喃酮結構是一類重要的雜環(huán)化合物，經(jīng)常出現(xiàn)在具有顯著藥理作用的天然產(chǎn)物中，研究領域也在不斷擴大。它們具有廣泛的藥物活性:抗白內(nèi)障、抗癌、抗菌、消炎、抗驚厥。本文對天然呋喃酮類化合物的研究進展、合成方法及其生物學效應進行了綜述。固相法、交叉偶聯(lián)反應、美拉德式反應、醇與苯基氧化腈的環(huán)加成反應、側鏈修飾反應是制備呋喃酮衍生物的幾種反應類型。本文綜述了呋喃酮骨架的制備方法和藥理活性，將有助于藥物化學家設計和執(zhí)行新的方法來尋找新藥。[4]

呋喃酮及其衍生物的藥理活性[4]

4、2,5-二甲基-4-羥基-3[2H]-呋喃酮β-d-葡萄糖醛酸作為人類草莓風味成分主要代謝物鑒定

2,5-二甲基-4-羥基-3[2H]呋喃酮(Furaneol?，DMHF)[3658-77-3]是草莓果實的一種重要的香味成分。通過檢測尿中DMHF和DMHF葡萄糖醛酸水平來確定排泄量。合成了DMHF 葡萄糖醛酸，并通過1H、13C、二維核磁共振和質譜數(shù)據(jù)對其結構進行了鑒定。采用反相高效液相色譜法(XAD-2)固相萃取、在線紫外/可見光譜(UV/VIS)或電噴霧串聯(lián)質譜(electrospray - tandem - mass spectrometry)檢測人尿中DMHF 葡萄糖醛酸的含量。男性和女性志愿者在24小時內(nèi)分別以DMHF葡糖苷酸的形式在尿液中排泄出DMHF劑量(草莓中游離和糖苷結合DMHF總量)的59-69%和81-94%。在草莓果實中，DMHF的排泄量與DMHF的劑量大小和游離與糖苷結合形式的比例無關。天然存在于草莓中的二氫呋喃、二氫呋喃葡萄糖苷及其6 '- o -丙二酰衍生物在人類尿液中均未檢測到。[5]

5、吸引但有毒:糖基結合揮發(fā)物和糖基轉移酶參與其形成的新作用

植物會產(chǎn)生和釋放大量的揮發(fā)性、低分子量的化學物質，它們在生物體中發(fā)揮不同的作用，并在環(huán)境溫度下分散在空氣中?？諝庵械膿]發(fā)物構成了花朵的香味和種子植物果實的香味。數(shù)千年來，這些次級或特殊的植物代謝物被人類用作香水(香料)，并在食物中作為香味化合物和防腐劑。由蒸汽蒸餾法或從植物器官中提取而得的精油含有大部分揮發(fā)物，由于其疏水性成分具有細胞毒性作用，可作為化療藥物和麻醉劑，預防、治療和減輕疾病引起的疼痛。[6]

揮發(fā)物的生理作用包括對非生物和生物脅迫的化學防御，以及與其他生物的生物信息信號。植物產(chǎn)生揮發(fā)性代謝物的組成部分和/或響應外部刺激。在花朵和果實中，氣味分子分別起到吸引傳粉者和種子傳播者的作用。然而，揮發(fā)物在植物保護中也發(fā)揮著不同的作用。植物代謝物擊退并使食草動物中毒，賦予抗菌特性以對抗病原體，誘騙捕食食草動物的掠食性和寄生性昆蟲，誘導鄰近植物對即將到來的攻擊進行防御，并減弱氧化應激。植物揮發(fā)物在空間、發(fā)育和時間上通過不同的多步驟途徑生物合成，可分為萜類、脂肪酸衍生物、氨基酸衍生物、酚類和其他不能歸為其他基團的小分子。收集、濃縮、分離和鑒定植物揮發(fā)物的現(xiàn)代技術甚至可以檢測到最低水平的揮發(fā)物;在90種植物中已經(jīng)鑒定出1700多種揮發(fā)物，顯示出這類植物天然產(chǎn)物的巨大多樣性。[6]

圖1 GBVs研究進展時間軸

糖苷結合揮發(fā)物(GBVs)是一類較新的植物次生產(chǎn)物，這可能與它們在植物中的豐度低和經(jīng)常缺乏紫外-可見吸收光譜(無色)而妨礙分光光度計的檢測有關。此外，GBVs不揮發(fā)、無臭，不直接適用氣相色譜和感官分析。盡管一些現(xiàn)象，如薄荷在貯藏過程中精油含量的增加表明了結合單萜的存在，但直到1969年，第一個GBVs(香葉醇、橙花醇和香茅醇葡萄糖苷)才在玫瑰花瓣中被鑒定出來(圖1)單萜醇葡萄糖綴合形式的發(fā)現(xiàn)引起了人們對GBVs的研究。此后，在含油植物和非含油植物中，GBVs均被分離和結構鑒定;在某些情況下，GBVs的水平超過了揮發(fā)物的數(shù)量，比例范圍為2:1至5:1。在50多個植物科中發(fā)現(xiàn)了具有GBVs的物種，發(fā)現(xiàn)GBVs的發(fā)生不僅限于植物的地上部分，還包括根、根莖、花瓣和種子。雖然早在1974年就發(fā)現(xiàn)葡萄中存在GBVs，但單萜苷是1982年在一種糧食作物中首次發(fā)現(xiàn)的。[6]

圖2 茶葉和芒果果實糖苷結合的選擇性苷元

常報道的GBVs的苷元結構有短鏈和中鏈、直鏈和支鏈、不飽和和飽和醇和酸類、酚類和異戊烯醇，包括單萜醇、C13 -正異戊烯醇和倍半萜醇(圖2)。此外，雜化合物如呋喃酮、中鏈羥基酯和酸也是GBV的配基。后者在酶解后產(chǎn)生揮發(fā)性內(nèi)酯，這已被證明為橡樹內(nèi)酯。苷元來源于β-氧化和脂氧合酶途徑的脂肪酸代謝或由莽草酸酯和類異戊二烯途徑產(chǎn)生。甲基支鏈醇如2-甲基丁醇和3-甲基丁醇也可能從氨基酸代謝中得到。[6]

參考文獻

[1] Wilfried Schwab. Natural 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (Furaneol?). Molecules 2013, 18, 6936-6951; doi:10.3390/molecules18066936

[2] Sung, W.S. & Jung, Hyun Jun & Lee, I.S. & Kim, H.S. & Lee, D.G.. (2006). Antimicrobial effect of furaneol against human pathogenic bacteria and fungi. Journal of Microbiology and Biotechnology. 16. 349-354.

[3] Franziska Haag, Sandra Hoffmann, and Dietmar Krautwurst. Key Food Furanones Furaneol and Sotolone Specifically Activate Distinct Odorant Receptors. J. Agric. Food Chem. 2021, 69, 37, 10999–11005.https://doi.org/10.1021/acs.jafc.1c03314.

[4] Hosseinzadeh Zahra and Ramazani Ali *, An Overview of the Chemistry and Pharmacological Potentials of Furanones Skeletons, Current Organic Chemistry 2019; 23(14) . https: //dx. doi. org /10. 2174 /1385272 823666190820111928

[5] R. Roscher, H. Koch, M. Herderich, P. Schreier, W. Schwab, Identification of 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone β-d-glucuronide as the major metabolite of a strawberry flavour constituent in humans,Food and Chemical Toxicology,Volume 35, Issue 8,1997,Pages 777-782,ISSN 0278-6915, doi.10.1016/S0278-6915(97)00055-0.

[6] Chuankui Song, Katja Hartl , Kate McGraphery, Thomas Hoffmann and Wilfried Schwab. Attractive but Toxic: Emerging Roles of Glycosidically Bound Volatiles and Glycosyltransferases Involved in Their Formation. Molecular Plant,2018, 11, 1225-1236. https://doi.org/10.1016/j.molp.2018.09.001